ADN RECOMBINANTE
El ADN recombinante es el resultado de introducir fragmentos de ADN sintéticos o exógenos, procedentes de un organismo determinado, en un hospedador diferente, dando un organismo transgénico.
Si este ADN es viable, se replicará en una célula viva y se expresará, produciendo proteínas.
Las herramientas básicas para la manipulación de moléculas de ADN son dos enzimas, las endonucleasas de restricción y ADN ligasas.
Las endonucleasas de restricción, como la conocida Eco RI de E.coli:
- Son enzimas que cortan secuencias específicas de ADN que son capaces de reconocer, pues se acoplan a ellas por su centro activo.
- Muchas trabajan reconociendo secuencias palindrómicas, aquellas en las que la secuencia 5´-3´de una cadena es la misma que la 5´-3´de la cadena complementaria por lo que pueden dejar unos extremos cohesivos o pegajosos en los que hay un pequeño fragmento de ADN de cadena sencilla o, por el contrario, extremos romos, donde no aparece ADN de cadena sencilla.
Las ADN ligasas unen fragmentos de cadenas de ADN a través enlaces fosfodiéster, por ej., los extremos cohesivos de fragmentos de ADN generados por las endonucleasas de restricción.
Las enzimas de restricción actúan como las tijeras y las ADN ligasas son el pegamento que une los extremos cohesivos, cortados con las tijeras.
Posteriormente, dichas moléculas recombinantes deben de multiplicarse por medio de técnicas, como la clonación o la reacción en cadena de la polimerasa.
CLONACIÓN DE ADN IN VIVO
Para conseguir copias del gen o secuencia problema in vivo se introduce el ADN recombinado que lo porta, en una bacteria u otra célula huésped de rápida división como E. coli o Saccharomyces cerevisae, a través de un vector, como un plásmido, virus, cósmido o cromosoma artificial (como los YAC de levaduras), utilizando la maquinaria de esta célula huésped para replicar el ADN obtenido.
Así, como hemos visto en el anterior epígrafe, gracias a la actuación simultánea de las enzimas de restricción sobre nuestro ADN con el gen de interés y sobre el plásmido vectorial, podremos introducir, a través de los extremos pegajosos, dicho gen en el plásmido con la ayuda de las DNA ligasas.
Igualmente, en el mencionado vector deberemos de incluir algún marcador, es decir, un gen de fácil detección fenotípica, como un gen de resistencia a antibióticos, frecuentemente la ampicilina.
Posteriormente, tal ADN recombinante debe de ser introducido en organismos que lo acepten, como son aquellas bacterias que pueden dar fenómenos de transformación (un mecanismo de reproducción bacteriana en el que se traspasan los plásmidos).
Tras ello, las pondremos a crecer en medios de cultivo idóneos para su rápido crecimiento con el antibiótico al que es resistente dicho plásmido creado, seleccionando las cepas recombinantes de aquellas que no lo han incorporado.
Tras varias generaciones, tendremos millones de copias del material genético y, en consecuencia, del gen de interés, constituyendo una genoteca.
Igualmente, esta técnica no solo se utiliza para clonar el ADN, sino también para obtener, gracias a la expresión de los genes clonados, los productos generados por dicho gen, como la insulina, la hormona de crecimiento o el factor VIII de coagulación.
Clonación de genes de interés in vivo a través de la tecnología del ADN recombinante. Así, creamos un plásmido por medio de la técnica con el gen de interés y un marcador, como suele ser la resistencia a un determinado antibiótico. Por tanto, al introducirlo en una bacteria y crecerla en un medio de cultivo con dicho medicamento, solo tendremos las cepas recombinantes (aquellas que han incorporado el plásmido). Fuente: Khan Academy.
